Vektor dalam Terapi Gen - Terapi gen menggunakan fragmen DNA untuk memperbaiki gen yang mengalami kerusakan atau cacat , secara ex vivo maupun in vivo, dengan menggunakan vektor virus. Beberapa penelitian dengan menggunakan vektor adenovirus (AD) maupun herpes simpleks (HSV) mendapatkan peningkatan ekspresi bcl2 dan HSP72, sehingga mampu mencegah kematian sel neuron karena apoptosis. Peneliti lain mendapatkan berkurangnya nekrosis sel neuron karena iskemia, setelah transfeksi dengan gen antagonis reseptor interleukin.
1. Virus
Semua virus mengikat tuan rumah mereka dan memperkenalkan mereka materi genetik ke sel inang sebagai bagian dari siklus replikasi. Bahan genetik ini berisi dasar 'petunjuk' tentang bagaimana untuk menghasilkan lebih banyak salinan virus ini, pembajakan tubuh normal mesin produksi untuk melayani kebutuhan virus. Sel inang akan melaksanakan instruksi ini dan menghasilkan salinan tambahan dari virus, yang menyebabkan semakin banyak sel menjadi terinfeksi. Beberapa jenis virus secara fisik memasukkan gen mereka ke genom inang (fitur yang menentukan retrovirus, keluarga virus yang termasuk HIV, adalah bahwa virus akan memperkenalkan enzim reverse transcriptase ke dalam host dan dengan demikian menggunakan RNA sebagai "petunjuk" ). Ini mencakup gen virus di antara gen-gen sel inang untuk hidup dari sel.
Dokter dan ahli biologi molekular menyadari bahwa virus seperti ini dapat digunakan sebagai kendaraan untuk membawa 'baik' gen ke dalam sel manusia. Pertama, seorang ilmuwan akan menghilangkan gen dalam virus yang menyebabkan penyakit. Kemudian mereka akan menggantikan gen-gen dengan pengkodean gen efek yang diinginkan (misalnya, produksi insulin dalam kasus diabetes). Prosedur ini harus dilakukan sedemikian rupa sehingga gen yang memungkinkan virus untuk menyisipkan ke dalam genom genom inang yang tersisa utuh. Hal ini dapat membingungkan, dan memerlukan penelitian yang signifikan dan pemahaman virus gen untuk mengetahui fungsi dari masing-masing.
Contoh:
Sebuah virus ditemukan yang bereplikasi dengan menyisipkan gennya ke dalam sel inang genom. Virus ini memiliki dua gen-A dan B. Gen A mengkodekan protein yang memungkinkan virus ini untuk menyisipkan dirinya sendiri ke genom inang Gen B menyebabkan penyakit virus ini terkait dengan. Gen C adalah "normal" atau "diinginkan" gen yang kita inginkan di tempat gen B. Jadi, dengan rekayasa-ulang virus sehingga gen B digantikan oleh gen C, sementara memungkinkan gen A ke fungsi dengan benar, virus ini dapat diperlukan memperkenalkan gen - gen C ke dalam genom sel inang tanpa menimbulkan penyakit. Semua ini jelas merupakan penyederhanaan yang berlebihan, dan banyak masalah ada yang mencegah Terapi gen (Gene Therapy) menggunakan virus vektor, seperti: kesulitan mencegah efek yang tidak dikehendaki, menjamin virus akan menginfeksi sel sasaran yang tepat dalam tubuh, dan memastikan bahwa gen yang dimasukkan tidak mengganggu apapun gen vital sudah berada di dalam genom. Namun, modus dasar pengenalan gen saat ini menunjukkan banyak janji dan dokter dan ilmuwan sedang bekerja keras untuk memperbaiki setiap potensi masalah yang mungkin ada.
2. Retrovirus
Materi genetik dalam retrovirus adalah dalam bentuk RNA molekul, sedangkan materi genetik dari host mereka adalah dalam bentuk DNA. Ketika sebuah retrovirus yang menginfeksi sel inang, ia akan memperkenalkan para RNA bersama-sama dengan beberapa enzim, yaitu reverse transcriptase dan integrase, ke dalam sel. Molekul RNA ini dari retrovirus harus menghasilkan salinan DNA dari molekul RNA sebelum dapat diintegrasikan ke dalam bahan genetik sel inang. Proses produksi salinan DNA dari molekul RNA ini disebut transkripsi balik. Itu dilakukan oleh salah satu enzim yang dibawa dalam virus, yang disebut reverse transcriptase. Setelah DNA ini copy diproduksi dan bebas dalam inti sel inang, maka harus dimasukkan ke dalam genom sel inang. Artinya, ia harus dimasukkan ke dalam molekul DNA besar di sel (kromosom). Proses ini dilakukan oleh enzim lain dibawa dalam virus yang disebut integrase.
Sekarang bahwa materi genetik dari virus itu telah dimasukkan, dapat dikatakan bahwa sel inang telah dimodifikasi mengandung gen baru. Jika ini membagi sel inang kemudian, para keturunan akan semuanya mengandung gen baru. Kadang-kadang gen retrovirus tidak mengungkapkan informasi mereka dengan segera.Salah satu masalah Terapi gen (Gene Therapy) menggunakan retrovirus adalah bahwa enzim integrase dapat memasukkan materi genetik virus ke dalam suatu posisi sewenang-wenang dalam genom dari tuan rumah, melainkan secara acak mendorong materi genetik ke dalam kromosom. Jika bahan genetik yang terjadi untuk dimasukkan di tengah-tengah salah satu gen asli dari sel inang, gen ini akan terganggu (insertional mutagenesis). Jika gen kebetulan satu mengatur pembelahan sel, pembelahan sel yang tidak terkendali (yaitu, kanker) dapat terjadi. Masalah ini baru-baru ini mulai diatasi dengan memanfaatkan jari seng nucleases atau dengan memasukkan sekuens tertentu seperti beta-globin daerah kontrol lokus untuk mengarahkan lokasi integrasi ke situs kromosom tertentu. Percobaan Terapi gen (Gene Therapy) menggunakan vektor untuk mengobati retrovirus terkait-X parah gabungan immunodeficiency (X-SCID) merupakan aplikasi yang paling sukses terapi gen-to-date. Lebih dari dua puluh pasien telah diobati di Perancis dan Britania, dengan tingkat tinggi pemulihan sistem kekebalan yang diamati. Percobaan serupa dihentikan atau dibatasi di Amerika Serikat ketika leukemia dilaporkan pada pasien yang dirawat di Prancis X-SCID Terapi gen (Gene Therapy) sidang. Hingga saat ini, empat anak-anak di pengadilan Prancis dan satu lagi di pengadilan Inggris telah mengembangkan leukemia sebagai akibat dari insertional mutagenesis oleh vektor retroviral. Semua kecuali satu dari anak-anak ini merespon dengan baik konvensional pengobatan anti-leukemia. Terapi gen (Gene Therapy) cobaan untuk mengobati SCID karena kekurangan dari Adenosin Deaminase (ADA) enzim lanjutkan dengan relatif sukses di Amerika Serikat, Britania, Italia dan Jepang.
3. Adenoviruses
Adenoviruses adalah virus yang membawa materi genetik dalam bentuk DNA beruntai ganda. Mereka menyebabkan pernapasan, usus, dan infeksi mata pada manusia (khususnya flu biasa). Ketika virus ini menginfeksi sel inang, mereka memperkenalkan molekul DNA mereka ke dalam host. Materi genetik dari adenoviruses tidak dimasukkan (sementara) ke dalam sel inang bahan genetik. Molekul DNA dibiarkan bebas di dalam inti sel inang, dan petunjuk dalam ekstra ini adalah molekul DNA ditranskripsi sama seperti gen lain. Satu-satunya perbedaan adalah bahwa gen ekstra ini tidak direplikasi ketika sel akan menjalani pembelahan sel sehingga sel keturunan yang tidak akan memiliki gen tambahan. Akibatnya, perlakuan dengan adenovirus akan memerlukan readministration dalam populasi sel tumbuh walaupun tidak adanya integrasi ke dalam genom sel inang harus mencegah kanker jenis terlihat dalam persidangan SCID. Sistem vektor ini telah dipromosikan untuk mengobati kanker dan memang Terapi gen (Gene Therapy) pertama produk yang akan berlisensi untuk mengobati kanker, Terapi gen (Gene Therapy) telah disetujui oleh FDA Cina pada tahun 2003 untuk pengobatan kanker kepala dan leher. Kekhawatiran tentang keselamatan vektor adenovirus dibesarkan setelah kematian tahun 1999 Jesse Gelsinger saat turut berpartisipasi dalam percobaan terapi gen. Sejak itu, bekerja menggunakan vektor adenovirus telah difokuskan pada versi cacat genetis virus.
4. Adeno-associated virus
Adeno-associated virus, dari Parvovirus keluarga, virus kecil dengan genom DNA beruntai tunggal. Jenis AAV liar dapat memasukkan materi genetik pada situs spesifik pada kromosom 19 dengan hampir 100% kepastian. Tapi AAV rekombinan, yang tidak berisi virus hanya gen dan terapi gen, tidak berintegrasi ke dalam genom. Sebaliknya, genom virus rekombinan sekering pada ujung-ujungnya melalui Itr (terminal terbalik mengulangi) rekombinasi untuk membentuk lingkaran, bentuk-bentuk yang episomal diperkirakan menjadi penyebab utama dari ekspresi gen jangka panjang. Ada beberapa kelemahan untuk menggunakan AAV, termasuk jumlah kecil DNA itu dapat membawa (kapasitas yang rendah) dan kesulitan dalam menghasilkan itu. Jenis virus ini sedang digunakan, tetapi, karena non-patogenik (kebanyakan orang membawa virus berbahaya ini). Berbeda dengan adenoviruses, kebanyakan orang diperlakukan dengan tidak akan membangun AAV respon imun untuk menghapus virus dan sel-sel yang telah berhasil diobati dengan itu. Beberapa percobaan dengan AAV berada di-pergi atau dalam persiapan, terutama berusaha untuk mengobati penyakit otot dan mata; dua jaringan di mana virus tampaknya sangat berguna. Namun, uji klinis juga telah dimulai di mana vektor AAV digunakan untuk mengantarkan gen ke otak. Hal ini mungkin karena dapat menularkan virus AAV non-membagi (diam) sel-sel, seperti neuron di mana dinyatakan genom mereka untuk waktu yang lama.
5. Amplop pseudotyping protein virus vektor
Vektor virus yang dijelaskan di atas memiliki populasi sel inang alami bahwa mereka menginfeksi paling efisien. Retrovirus telah membatasi rentang sel inang alami, dan meskipun adenovirus dan Adeno-associated virus dapat menginfeksi yang relatif lebih luas sel secara efisien, beberapa tipe sel bahan tahan api untuk infeksi oleh virus ini juga. Lampiran ke dan masuk ke sel yang rentan ditengahi oleh amplop protein pada permukaan virus. virus memiliki satu lapisan protein membran mereka, sementara adenoviruses dilapisi dengan kedua sebuah amplop protein dan serat yang memanjang dari permukaan virus. Amplop protein pada masing-masing virus ini berikatan dengan permukaan sel-molekul seperti heparin sulfat, yang localizes mereka di atas permukaan potensi tuan rumah, serta dengan spesifik reseptor protein yang menginduksi baik entry-mempromosikan perubahan-perubahan struktural dalam protein virus, atau localizes virus di endosomes mana peningkatan keasaman dari lumen menginduksi melipat ini dari virus mantel. Dalam kedua kasus, masuk ke sel inang potensial memerlukan interaksi yang menguntungkan antara protein pada permukaan virus dan protein pada permukaan sel. Untuk keperluan terapi gen, satu mungkin baik ingin membatasi atau memperluas kisaran sel rentan terhadap transduksi oleh sebuah vektor terapi gen. Untuk tujuan ini, banyak vektor telah dikembangkan di mana protein amplop virus endogen telah digantikan oleh amplop baik protein dari virus lain, atau oleh chimeric protein. Seperti chimera akan terdiri dari bagian-bagian protein virus diperlukan untuk penggabungan ke dalam virion serta urutan dimaksudkan untuk berinteraksi dengan protein sel inang spesifik. Virus di mana protein amplop telah digantikan seperti yang dijelaskan disebut sebagai pseudotyped virus. Sebagai contoh, vektor retrovirus paling populer untuk digunakan dalam percobaan Terapi gen (Gene Therapy) telah menjadi Lentivirus Simian immunodeficiency virus dilapisi dengan amplop protein, G-protein, dari virus stomatitis vesikuler. Tropism ini merupakan karakteristik dari VSV G-protein yang dilapisi vektor ini. Banyak usaha telah dibuat untuk membatasi virus tropism vektor untuk satu atau beberapa sel inang populasi. Muka ini akan memungkinkan untuk administrasi sistemik yang relatif sedikit vektor. Potensi untuk off-sel sasaran modifikasi akan dibatasi, dan banyak perhatian dari masyarakat medis akan berkurang. Kebanyakan upaya untuk membatasi tropism telah menggunakan bantalan protein amplop chimeric antibodi fragmen. Menunjukkan vektor ini sangat menjanjikan untuk pengembangan "peluru ajaib" terapi gen.
6. Non-virus metode
Metode non-virus sekarang keuntungan tertentu atas metode virus, dengan produksi skala besar sederhana dan rendah imunogenisitas host yang hanya dua. Sebelumnya, rendahnya tingkat transfection dan ekspresi gen memegang metode non-virus pada posisi yang kurang menguntungkan, namun kemajuan terbaru dalam teknologi vektor menghasilkan molekul dan teknik dengan efisiensi transfection mirip dengan virus.
7. DNA Telanjang
Ini adalah metode yang paling sederhana non-virus transfection. Dilakukan uji klinis dari injeksi intramuskular dari DNA telanjang plasmid telah terjadi dengan beberapa keberhasilan, namun ekspresi telah sangat rendah dibandingkan dengan metode lain transfection. Selain persidangan dengan plasmid, telah ada pengadilan dengan telanjang PCR produk, yang memiliki kesamaan atau kesuksesan yang lebih besar. Keberhasilan ini, bagaimanapun, tidak membandingkan dengan metode lainnya, penelitian yang mengarah ke metode yang lebih efisien untuk pengiriman dari DNA telanjang seperti elektroporasi, sonoporation, dan penggunaan "pistol gen", yang dilapisi emas tunas partikel DNA ke dalam sel dengan menggunakan gas bertekanan tinggi.
8. Oligonucleotides
Penggunaan sintetis oligonucleotides dalam Terapi gen (Gene Therapy) adalah untuk menonaktifkan gen-gen yang terlibat dalam proses penyakit. Salah satu strategi menggunakan antisense yang spesifik untuk gen target untuk mengganggu transkripsi gen yang rusak. Lain menggunakan molekul-molekul kecil RNA yang disebut siRNA untuk sinyal sel untuk membelah spesifik sekuens unik dalam mRNA transkripsi gen yang rusak, mengganggu terjemahan mRNA yang salah, dan karena ekspresi gen Strategi lebih lanjut menggunakan oligodeoxynucleotides untai ganda sebagai umpan untuk faktor transkripsi yang diperlukan untuk mengaktifkan transkripsi gen target. Faktor transkripsi berikatan dengan umpan bukan promotor gen yang rusak, yang mengurangi target transkripsi gen, menurunkan ekspresi. Selain itu, oligonucleotides DNA beruntai tunggal telah digunakan untuk mengarahkan perubahan satu basa dalam gen mutan. Yang oligonukleotida dirancang untuk anil dengan melengkapi untuk target gen dengan pengecualian dari sebuah pusat dasar, basis sasaran, yang berfungsi sebagai dasar template untuk diperbaiki. Teknik ini disebut sebagai gen dimediasikan oligonukleotida perbaikan, tertarget gen perbaikan, atau ditargetkan perubahan nukleotida.
9. Lipoplexes dan polyplexes
Untuk meningkatkan pengiriman DNA baru ke dalam sel, DNA harus dilindungi dari kerusakan dan masuk ke dalam sel harus difasilitasi. Untuk tujuan ini molekul-molekul baru, lipoplexes dan polyplexes, telah diciptakan yang memiliki kemampuan untuk melindungi DNA dari kerusakan yang tidak diinginkan selama proses transfection. Plasmid DNA dapat ditutupi dengan lemak dalam struktur terorganisir seperti micelle atau liposome. Ketika struktur terorganisasi complexed dengan DNA itu disebut lipoplex. There Ada tiga jenis lipid, Anionic (bermuatan negatif), netral, atau kationik (bermuatan positif). Anionic dan netral lipid digunakan untuk pembangunan sintetis lipoplexes vektor. Namun, terlepas dari fakta-fakta yang ada sedikit toksisitas terkait dengan mereka, bahwa mereka yang kompatibel dengan cairan tubuh dan bahwa ada kemungkinan mereka untuk menyesuaikan jaringan spesifik; mereka adalah rumit dan menyita waktu untuk menghasilkan perhatian sehingga berubah menjadi versi yang kationik.Cationic lipids.
Cationic lipid, karena mereka muatan positif, yang pertama kali digunakan untuk memadatkan molekul DNA bermuatan negatif sehingga memudahkan enkapsulasi DNA menjadi liposomes.Kemudian ditemukan bahwa penggunaan lipid kationik secara signifikan meningkatkan stabilitas lipoplexes. Juga sebagai hasil dari biaya, kationik liposomes berinteraksi dengan membran sel, endositosis secara luas dipercaya sebagai rute utama dengan pengambilan sel yang lipoplexes. Endosomes terbentuk sebagai hasil endositosis Namun, jika gen tidak dapat dilepaskan ke sitoplasma oleh membran melanggar endosome, mereka akan dikirim ke lisosom di mana semua DNA akan dihancurkan sebelum mereka bisa mencapai fungsi mereka. Hal itu juga ditemukan bahwa meskipun kationik lipid sendiri dapat mengembun dan membungkus DNA ke dalam liposomes, transfection efisiensi yang sangat rendah karena kurangnya kemampuan dalam hal "endosomal melarikan diri". Namun, ketika penolong lipid (biasanya electroneutral lipid, seperti obat bius) yang ditambahkan untuk membentuk lipoplexes, jauh lebih tinggi efisiensi transfection diamati. Belakangan, ia tahu bahwa lipid tertentu memiliki kemampuan untuk mengacaukan endosomal membran sehingga memudahkan pelarian DNA dari endosome, karena itu mereka disebut fusogenic lipid. Meskipun kationik liposomes telah digunakan secara luas sebagai alternatif untuk pengiriman gen vektor, tergantung dosis toksisitas kationik lipid juga diamati yang dapat membatasi penggunaan terapi mereka.
Penggunaan yang paling umum dari lipoplexes telah di transfer gen ke dalam sel-sel kanker, di mana disediakan gen supresor tumor telah mengaktifkan kontrol gen dalam sel dan mengurangi aktivitas onkogen. Studi terbaru menunjukkan lipoplexes untuk berguna dalam pernafasan transfecting sel epitel, sehingga mereka dapat digunakan untuk pengobatan penyakit pernapasan genetik seperti cystic fibrosis. Polimer kompleks dengan DNA disebut polyplexes. Sebagian besar terdiri dari polyplexes kationik polimer dan produksi mereka diatur oleh interaksi ionik. Salah satu perbedaan besar antara metode tindakan polyplexes dan lipoplexes adalah bahwa polyplexes tidak dapat melepaskan beban DNA mereka ke dalam sitoplasma, sehingga untuk tujuan ini, bersama-transfection endosome-litik dengan agen (untuk melisiskan yang endosome yang dibuat selama endositosis, proses oleh yang memasuki sel polyplex) seperti adenovirus tidak aktif harus terjadi. . Namun, hal ini tidak selalu terjadi, polimer seperti polyethylenimine memiliki metode mereka sendiri seperti halnya gangguan endosome Chitosan dan trimethylchitosan.
10. Hybrid metode
Virosomes are one example; they combine liposomes with an inactivated HIV or influenza virus . Karena setiap metode transfer gen memiliki kekurangan, ada beberapa metode yang dikembangkan hibrid yang menggabungkan dua atau lebih teknik. Virosomes adalah satu contoh; mereka menggabungkan liposomes dengan tidak aktif HIV atau virus influenza. Hal ini telah terbukti mempunyai lebih efisien dalam transfer gen pernafasan sel epitel daripada virus atau metode liposomal sendirian. Metode lain melibatkan pencampuran virus lainnya vektor dengan kationik lipid atau hybridising virus.
11. Dendrimers
Sebuah dendrimer adalah cabang sangat makromolekul dengan bentuk bulat. Permukaan partikel dapat functionalized dalam banyak cara dan banyak sifat membangun yang dihasilkan ditentukan oleh permukaannya. Secara khusus adalah mungkin untuk membangun sebuah kationik dendrimer, yaitu satu dengan muatan permukaan positif. Ketika di hadapan materi genetik seperti DNA atau RNA, biaya complimentarity mengarah ke asosiasi sementara dari asam nukleat dengan Di mencapai tujuan yang dendrimer-kompleks asam nukleat ini kemudian dibawa ke dalam sel melalui endositosis.Dalam beberapa tahun terakhir patokan bagi agen transfection telah kationik lipid. Keterbatasan reagen bersaing ini telah dilaporkan meliputi: kurangnya kemampuan untuk transfect beberapa jenis sel, kurangnya kemampuan penargetan aktif yang kuat, ketidaksesuaian dengan model binatang, dan keracunan. Dendrimers menawarkan kovalen kuat konstruksi dan ekstrim kontrol atas struktur molekul, dan karenanya ukuran. Bersama-sama ini memberikan keuntungan yang menarik dibandingkan dengan pendekatan yang ada. Memproduksi dendrimers secara historis menjadi lambat dan proses mahal yang terdiri dari berbagai reaksi lambat, sebuah rintangan yang sangat membatasi pengembangan komersial mereka. Perusahaan yang berbasis di Michigan dendritik Nanotechnologies menemukan metode untuk menghasilkan kinetically didorong dendrimers menggunakan kimia, sebuah proses yang tidak hanya dikurangi oleh biaya yang besarnya tiga, tetapi juga mengurangi waktu reaksi lebih dari satu bulan untuk beberapa hari. Ini baru "Priostar" dendrimers dapat secara khusus dibangun untuk membawa muatan DNA atau RNA yang sel transfects efisiensi yang tinggi dengan sedikit atau tanpa toksisitas. Baca juga Pengertian terapi gen Jenis-jenis terapi gen Vektor dalam terapi gen terapi gen senjata baru melawan penyakit
1. Virus
Semua virus mengikat tuan rumah mereka dan memperkenalkan mereka materi genetik ke sel inang sebagai bagian dari siklus replikasi. Bahan genetik ini berisi dasar 'petunjuk' tentang bagaimana untuk menghasilkan lebih banyak salinan virus ini, pembajakan tubuh normal mesin produksi untuk melayani kebutuhan virus. Sel inang akan melaksanakan instruksi ini dan menghasilkan salinan tambahan dari virus, yang menyebabkan semakin banyak sel menjadi terinfeksi. Beberapa jenis virus secara fisik memasukkan gen mereka ke genom inang (fitur yang menentukan retrovirus, keluarga virus yang termasuk HIV, adalah bahwa virus akan memperkenalkan enzim reverse transcriptase ke dalam host dan dengan demikian menggunakan RNA sebagai "petunjuk" ). Ini mencakup gen virus di antara gen-gen sel inang untuk hidup dari sel.
Dokter dan ahli biologi molekular menyadari bahwa virus seperti ini dapat digunakan sebagai kendaraan untuk membawa 'baik' gen ke dalam sel manusia. Pertama, seorang ilmuwan akan menghilangkan gen dalam virus yang menyebabkan penyakit. Kemudian mereka akan menggantikan gen-gen dengan pengkodean gen efek yang diinginkan (misalnya, produksi insulin dalam kasus diabetes). Prosedur ini harus dilakukan sedemikian rupa sehingga gen yang memungkinkan virus untuk menyisipkan ke dalam genom genom inang yang tersisa utuh. Hal ini dapat membingungkan, dan memerlukan penelitian yang signifikan dan pemahaman virus gen untuk mengetahui fungsi dari masing-masing.
Contoh:
Sebuah virus ditemukan yang bereplikasi dengan menyisipkan gennya ke dalam sel inang genom. Virus ini memiliki dua gen-A dan B. Gen A mengkodekan protein yang memungkinkan virus ini untuk menyisipkan dirinya sendiri ke genom inang Gen B menyebabkan penyakit virus ini terkait dengan. Gen C adalah "normal" atau "diinginkan" gen yang kita inginkan di tempat gen B. Jadi, dengan rekayasa-ulang virus sehingga gen B digantikan oleh gen C, sementara memungkinkan gen A ke fungsi dengan benar, virus ini dapat diperlukan memperkenalkan gen - gen C ke dalam genom sel inang tanpa menimbulkan penyakit. Semua ini jelas merupakan penyederhanaan yang berlebihan, dan banyak masalah ada yang mencegah Terapi gen (Gene Therapy) menggunakan virus vektor, seperti: kesulitan mencegah efek yang tidak dikehendaki, menjamin virus akan menginfeksi sel sasaran yang tepat dalam tubuh, dan memastikan bahwa gen yang dimasukkan tidak mengganggu apapun gen vital sudah berada di dalam genom. Namun, modus dasar pengenalan gen saat ini menunjukkan banyak janji dan dokter dan ilmuwan sedang bekerja keras untuk memperbaiki setiap potensi masalah yang mungkin ada.
2. Retrovirus
Materi genetik dalam retrovirus adalah dalam bentuk RNA molekul, sedangkan materi genetik dari host mereka adalah dalam bentuk DNA. Ketika sebuah retrovirus yang menginfeksi sel inang, ia akan memperkenalkan para RNA bersama-sama dengan beberapa enzim, yaitu reverse transcriptase dan integrase, ke dalam sel. Molekul RNA ini dari retrovirus harus menghasilkan salinan DNA dari molekul RNA sebelum dapat diintegrasikan ke dalam bahan genetik sel inang. Proses produksi salinan DNA dari molekul RNA ini disebut transkripsi balik. Itu dilakukan oleh salah satu enzim yang dibawa dalam virus, yang disebut reverse transcriptase. Setelah DNA ini copy diproduksi dan bebas dalam inti sel inang, maka harus dimasukkan ke dalam genom sel inang. Artinya, ia harus dimasukkan ke dalam molekul DNA besar di sel (kromosom). Proses ini dilakukan oleh enzim lain dibawa dalam virus yang disebut integrase.
Sekarang bahwa materi genetik dari virus itu telah dimasukkan, dapat dikatakan bahwa sel inang telah dimodifikasi mengandung gen baru. Jika ini membagi sel inang kemudian, para keturunan akan semuanya mengandung gen baru. Kadang-kadang gen retrovirus tidak mengungkapkan informasi mereka dengan segera.Salah satu masalah Terapi gen (Gene Therapy) menggunakan retrovirus adalah bahwa enzim integrase dapat memasukkan materi genetik virus ke dalam suatu posisi sewenang-wenang dalam genom dari tuan rumah, melainkan secara acak mendorong materi genetik ke dalam kromosom. Jika bahan genetik yang terjadi untuk dimasukkan di tengah-tengah salah satu gen asli dari sel inang, gen ini akan terganggu (insertional mutagenesis). Jika gen kebetulan satu mengatur pembelahan sel, pembelahan sel yang tidak terkendali (yaitu, kanker) dapat terjadi. Masalah ini baru-baru ini mulai diatasi dengan memanfaatkan jari seng nucleases atau dengan memasukkan sekuens tertentu seperti beta-globin daerah kontrol lokus untuk mengarahkan lokasi integrasi ke situs kromosom tertentu. Percobaan Terapi gen (Gene Therapy) menggunakan vektor untuk mengobati retrovirus terkait-X parah gabungan immunodeficiency (X-SCID) merupakan aplikasi yang paling sukses terapi gen-to-date. Lebih dari dua puluh pasien telah diobati di Perancis dan Britania, dengan tingkat tinggi pemulihan sistem kekebalan yang diamati. Percobaan serupa dihentikan atau dibatasi di Amerika Serikat ketika leukemia dilaporkan pada pasien yang dirawat di Prancis X-SCID Terapi gen (Gene Therapy) sidang. Hingga saat ini, empat anak-anak di pengadilan Prancis dan satu lagi di pengadilan Inggris telah mengembangkan leukemia sebagai akibat dari insertional mutagenesis oleh vektor retroviral. Semua kecuali satu dari anak-anak ini merespon dengan baik konvensional pengobatan anti-leukemia. Terapi gen (Gene Therapy) cobaan untuk mengobati SCID karena kekurangan dari Adenosin Deaminase (ADA) enzim lanjutkan dengan relatif sukses di Amerika Serikat, Britania, Italia dan Jepang.
3. Adenoviruses
Adenoviruses adalah virus yang membawa materi genetik dalam bentuk DNA beruntai ganda. Mereka menyebabkan pernapasan, usus, dan infeksi mata pada manusia (khususnya flu biasa). Ketika virus ini menginfeksi sel inang, mereka memperkenalkan molekul DNA mereka ke dalam host. Materi genetik dari adenoviruses tidak dimasukkan (sementara) ke dalam sel inang bahan genetik. Molekul DNA dibiarkan bebas di dalam inti sel inang, dan petunjuk dalam ekstra ini adalah molekul DNA ditranskripsi sama seperti gen lain. Satu-satunya perbedaan adalah bahwa gen ekstra ini tidak direplikasi ketika sel akan menjalani pembelahan sel sehingga sel keturunan yang tidak akan memiliki gen tambahan. Akibatnya, perlakuan dengan adenovirus akan memerlukan readministration dalam populasi sel tumbuh walaupun tidak adanya integrasi ke dalam genom sel inang harus mencegah kanker jenis terlihat dalam persidangan SCID. Sistem vektor ini telah dipromosikan untuk mengobati kanker dan memang Terapi gen (Gene Therapy) pertama produk yang akan berlisensi untuk mengobati kanker, Terapi gen (Gene Therapy) telah disetujui oleh FDA Cina pada tahun 2003 untuk pengobatan kanker kepala dan leher. Kekhawatiran tentang keselamatan vektor adenovirus dibesarkan setelah kematian tahun 1999 Jesse Gelsinger saat turut berpartisipasi dalam percobaan terapi gen. Sejak itu, bekerja menggunakan vektor adenovirus telah difokuskan pada versi cacat genetis virus.
4. Adeno-associated virus
Adeno-associated virus, dari Parvovirus keluarga, virus kecil dengan genom DNA beruntai tunggal. Jenis AAV liar dapat memasukkan materi genetik pada situs spesifik pada kromosom 19 dengan hampir 100% kepastian. Tapi AAV rekombinan, yang tidak berisi virus hanya gen dan terapi gen, tidak berintegrasi ke dalam genom. Sebaliknya, genom virus rekombinan sekering pada ujung-ujungnya melalui Itr (terminal terbalik mengulangi) rekombinasi untuk membentuk lingkaran, bentuk-bentuk yang episomal diperkirakan menjadi penyebab utama dari ekspresi gen jangka panjang. Ada beberapa kelemahan untuk menggunakan AAV, termasuk jumlah kecil DNA itu dapat membawa (kapasitas yang rendah) dan kesulitan dalam menghasilkan itu. Jenis virus ini sedang digunakan, tetapi, karena non-patogenik (kebanyakan orang membawa virus berbahaya ini). Berbeda dengan adenoviruses, kebanyakan orang diperlakukan dengan tidak akan membangun AAV respon imun untuk menghapus virus dan sel-sel yang telah berhasil diobati dengan itu. Beberapa percobaan dengan AAV berada di-pergi atau dalam persiapan, terutama berusaha untuk mengobati penyakit otot dan mata; dua jaringan di mana virus tampaknya sangat berguna. Namun, uji klinis juga telah dimulai di mana vektor AAV digunakan untuk mengantarkan gen ke otak. Hal ini mungkin karena dapat menularkan virus AAV non-membagi (diam) sel-sel, seperti neuron di mana dinyatakan genom mereka untuk waktu yang lama.
5. Amplop pseudotyping protein virus vektor
Vektor virus yang dijelaskan di atas memiliki populasi sel inang alami bahwa mereka menginfeksi paling efisien. Retrovirus telah membatasi rentang sel inang alami, dan meskipun adenovirus dan Adeno-associated virus dapat menginfeksi yang relatif lebih luas sel secara efisien, beberapa tipe sel bahan tahan api untuk infeksi oleh virus ini juga. Lampiran ke dan masuk ke sel yang rentan ditengahi oleh amplop protein pada permukaan virus. virus memiliki satu lapisan protein membran mereka, sementara adenoviruses dilapisi dengan kedua sebuah amplop protein dan serat yang memanjang dari permukaan virus. Amplop protein pada masing-masing virus ini berikatan dengan permukaan sel-molekul seperti heparin sulfat, yang localizes mereka di atas permukaan potensi tuan rumah, serta dengan spesifik reseptor protein yang menginduksi baik entry-mempromosikan perubahan-perubahan struktural dalam protein virus, atau localizes virus di endosomes mana peningkatan keasaman dari lumen menginduksi melipat ini dari virus mantel. Dalam kedua kasus, masuk ke sel inang potensial memerlukan interaksi yang menguntungkan antara protein pada permukaan virus dan protein pada permukaan sel. Untuk keperluan terapi gen, satu mungkin baik ingin membatasi atau memperluas kisaran sel rentan terhadap transduksi oleh sebuah vektor terapi gen. Untuk tujuan ini, banyak vektor telah dikembangkan di mana protein amplop virus endogen telah digantikan oleh amplop baik protein dari virus lain, atau oleh chimeric protein. Seperti chimera akan terdiri dari bagian-bagian protein virus diperlukan untuk penggabungan ke dalam virion serta urutan dimaksudkan untuk berinteraksi dengan protein sel inang spesifik. Virus di mana protein amplop telah digantikan seperti yang dijelaskan disebut sebagai pseudotyped virus. Sebagai contoh, vektor retrovirus paling populer untuk digunakan dalam percobaan Terapi gen (Gene Therapy) telah menjadi Lentivirus Simian immunodeficiency virus dilapisi dengan amplop protein, G-protein, dari virus stomatitis vesikuler. Tropism ini merupakan karakteristik dari VSV G-protein yang dilapisi vektor ini. Banyak usaha telah dibuat untuk membatasi virus tropism vektor untuk satu atau beberapa sel inang populasi. Muka ini akan memungkinkan untuk administrasi sistemik yang relatif sedikit vektor. Potensi untuk off-sel sasaran modifikasi akan dibatasi, dan banyak perhatian dari masyarakat medis akan berkurang. Kebanyakan upaya untuk membatasi tropism telah menggunakan bantalan protein amplop chimeric antibodi fragmen. Menunjukkan vektor ini sangat menjanjikan untuk pengembangan "peluru ajaib" terapi gen.
6. Non-virus metode
Metode non-virus sekarang keuntungan tertentu atas metode virus, dengan produksi skala besar sederhana dan rendah imunogenisitas host yang hanya dua. Sebelumnya, rendahnya tingkat transfection dan ekspresi gen memegang metode non-virus pada posisi yang kurang menguntungkan, namun kemajuan terbaru dalam teknologi vektor menghasilkan molekul dan teknik dengan efisiensi transfection mirip dengan virus.
7. DNA Telanjang
Ini adalah metode yang paling sederhana non-virus transfection. Dilakukan uji klinis dari injeksi intramuskular dari DNA telanjang plasmid telah terjadi dengan beberapa keberhasilan, namun ekspresi telah sangat rendah dibandingkan dengan metode lain transfection. Selain persidangan dengan plasmid, telah ada pengadilan dengan telanjang PCR produk, yang memiliki kesamaan atau kesuksesan yang lebih besar. Keberhasilan ini, bagaimanapun, tidak membandingkan dengan metode lainnya, penelitian yang mengarah ke metode yang lebih efisien untuk pengiriman dari DNA telanjang seperti elektroporasi, sonoporation, dan penggunaan "pistol gen", yang dilapisi emas tunas partikel DNA ke dalam sel dengan menggunakan gas bertekanan tinggi.
8. Oligonucleotides
Penggunaan sintetis oligonucleotides dalam Terapi gen (Gene Therapy) adalah untuk menonaktifkan gen-gen yang terlibat dalam proses penyakit. Salah satu strategi menggunakan antisense yang spesifik untuk gen target untuk mengganggu transkripsi gen yang rusak. Lain menggunakan molekul-molekul kecil RNA yang disebut siRNA untuk sinyal sel untuk membelah spesifik sekuens unik dalam mRNA transkripsi gen yang rusak, mengganggu terjemahan mRNA yang salah, dan karena ekspresi gen Strategi lebih lanjut menggunakan oligodeoxynucleotides untai ganda sebagai umpan untuk faktor transkripsi yang diperlukan untuk mengaktifkan transkripsi gen target. Faktor transkripsi berikatan dengan umpan bukan promotor gen yang rusak, yang mengurangi target transkripsi gen, menurunkan ekspresi. Selain itu, oligonucleotides DNA beruntai tunggal telah digunakan untuk mengarahkan perubahan satu basa dalam gen mutan. Yang oligonukleotida dirancang untuk anil dengan melengkapi untuk target gen dengan pengecualian dari sebuah pusat dasar, basis sasaran, yang berfungsi sebagai dasar template untuk diperbaiki. Teknik ini disebut sebagai gen dimediasikan oligonukleotida perbaikan, tertarget gen perbaikan, atau ditargetkan perubahan nukleotida.
9. Lipoplexes dan polyplexes
Untuk meningkatkan pengiriman DNA baru ke dalam sel, DNA harus dilindungi dari kerusakan dan masuk ke dalam sel harus difasilitasi. Untuk tujuan ini molekul-molekul baru, lipoplexes dan polyplexes, telah diciptakan yang memiliki kemampuan untuk melindungi DNA dari kerusakan yang tidak diinginkan selama proses transfection. Plasmid DNA dapat ditutupi dengan lemak dalam struktur terorganisir seperti micelle atau liposome. Ketika struktur terorganisasi complexed dengan DNA itu disebut lipoplex. There Ada tiga jenis lipid, Anionic (bermuatan negatif), netral, atau kationik (bermuatan positif). Anionic dan netral lipid digunakan untuk pembangunan sintetis lipoplexes vektor. Namun, terlepas dari fakta-fakta yang ada sedikit toksisitas terkait dengan mereka, bahwa mereka yang kompatibel dengan cairan tubuh dan bahwa ada kemungkinan mereka untuk menyesuaikan jaringan spesifik; mereka adalah rumit dan menyita waktu untuk menghasilkan perhatian sehingga berubah menjadi versi yang kationik.Cationic lipids.
Cationic lipid, karena mereka muatan positif, yang pertama kali digunakan untuk memadatkan molekul DNA bermuatan negatif sehingga memudahkan enkapsulasi DNA menjadi liposomes.Kemudian ditemukan bahwa penggunaan lipid kationik secara signifikan meningkatkan stabilitas lipoplexes. Juga sebagai hasil dari biaya, kationik liposomes berinteraksi dengan membran sel, endositosis secara luas dipercaya sebagai rute utama dengan pengambilan sel yang lipoplexes. Endosomes terbentuk sebagai hasil endositosis Namun, jika gen tidak dapat dilepaskan ke sitoplasma oleh membran melanggar endosome, mereka akan dikirim ke lisosom di mana semua DNA akan dihancurkan sebelum mereka bisa mencapai fungsi mereka. Hal itu juga ditemukan bahwa meskipun kationik lipid sendiri dapat mengembun dan membungkus DNA ke dalam liposomes, transfection efisiensi yang sangat rendah karena kurangnya kemampuan dalam hal "endosomal melarikan diri". Namun, ketika penolong lipid (biasanya electroneutral lipid, seperti obat bius) yang ditambahkan untuk membentuk lipoplexes, jauh lebih tinggi efisiensi transfection diamati. Belakangan, ia tahu bahwa lipid tertentu memiliki kemampuan untuk mengacaukan endosomal membran sehingga memudahkan pelarian DNA dari endosome, karena itu mereka disebut fusogenic lipid. Meskipun kationik liposomes telah digunakan secara luas sebagai alternatif untuk pengiriman gen vektor, tergantung dosis toksisitas kationik lipid juga diamati yang dapat membatasi penggunaan terapi mereka.
Penggunaan yang paling umum dari lipoplexes telah di transfer gen ke dalam sel-sel kanker, di mana disediakan gen supresor tumor telah mengaktifkan kontrol gen dalam sel dan mengurangi aktivitas onkogen. Studi terbaru menunjukkan lipoplexes untuk berguna dalam pernafasan transfecting sel epitel, sehingga mereka dapat digunakan untuk pengobatan penyakit pernapasan genetik seperti cystic fibrosis. Polimer kompleks dengan DNA disebut polyplexes. Sebagian besar terdiri dari polyplexes kationik polimer dan produksi mereka diatur oleh interaksi ionik. Salah satu perbedaan besar antara metode tindakan polyplexes dan lipoplexes adalah bahwa polyplexes tidak dapat melepaskan beban DNA mereka ke dalam sitoplasma, sehingga untuk tujuan ini, bersama-transfection endosome-litik dengan agen (untuk melisiskan yang endosome yang dibuat selama endositosis, proses oleh yang memasuki sel polyplex) seperti adenovirus tidak aktif harus terjadi. . Namun, hal ini tidak selalu terjadi, polimer seperti polyethylenimine memiliki metode mereka sendiri seperti halnya gangguan endosome Chitosan dan trimethylchitosan.
10. Hybrid metode
Virosomes are one example; they combine liposomes with an inactivated HIV or influenza virus . Karena setiap metode transfer gen memiliki kekurangan, ada beberapa metode yang dikembangkan hibrid yang menggabungkan dua atau lebih teknik. Virosomes adalah satu contoh; mereka menggabungkan liposomes dengan tidak aktif HIV atau virus influenza. Hal ini telah terbukti mempunyai lebih efisien dalam transfer gen pernafasan sel epitel daripada virus atau metode liposomal sendirian. Metode lain melibatkan pencampuran virus lainnya vektor dengan kationik lipid atau hybridising virus.
11. Dendrimers
Sebuah dendrimer adalah cabang sangat makromolekul dengan bentuk bulat. Permukaan partikel dapat functionalized dalam banyak cara dan banyak sifat membangun yang dihasilkan ditentukan oleh permukaannya. Secara khusus adalah mungkin untuk membangun sebuah kationik dendrimer, yaitu satu dengan muatan permukaan positif. Ketika di hadapan materi genetik seperti DNA atau RNA, biaya complimentarity mengarah ke asosiasi sementara dari asam nukleat dengan Di mencapai tujuan yang dendrimer-kompleks asam nukleat ini kemudian dibawa ke dalam sel melalui endositosis.Dalam beberapa tahun terakhir patokan bagi agen transfection telah kationik lipid. Keterbatasan reagen bersaing ini telah dilaporkan meliputi: kurangnya kemampuan untuk transfect beberapa jenis sel, kurangnya kemampuan penargetan aktif yang kuat, ketidaksesuaian dengan model binatang, dan keracunan. Dendrimers menawarkan kovalen kuat konstruksi dan ekstrim kontrol atas struktur molekul, dan karenanya ukuran. Bersama-sama ini memberikan keuntungan yang menarik dibandingkan dengan pendekatan yang ada. Memproduksi dendrimers secara historis menjadi lambat dan proses mahal yang terdiri dari berbagai reaksi lambat, sebuah rintangan yang sangat membatasi pengembangan komersial mereka. Perusahaan yang berbasis di Michigan dendritik Nanotechnologies menemukan metode untuk menghasilkan kinetically didorong dendrimers menggunakan kimia, sebuah proses yang tidak hanya dikurangi oleh biaya yang besarnya tiga, tetapi juga mengurangi waktu reaksi lebih dari satu bulan untuk beberapa hari. Ini baru "Priostar" dendrimers dapat secara khusus dibangun untuk membawa muatan DNA atau RNA yang sel transfects efisiensi yang tinggi dengan sedikit atau tanpa toksisitas. Baca juga Pengertian terapi gen Jenis-jenis terapi gen Vektor dalam terapi gen terapi gen senjata baru melawan penyakit
SUBSCRIBE TO OUR NEWSLETTER
Selamat Berjuang......
BalasHapusSelamat Berjuang......
BalasHapusSelamat Berjuang......
BalasHapus